The role of synaptic activity in the development of the mouse central nervous system

Abstract

Het doel van dit proefschrift was het karakteriseren van de rol die neurotransmitter speelt in de ontwikkeling en het stabiliseren van het zenuwstelsel in de muis. Hiertoe is de Munc18-1 deficiente muis als modelsysteem gebruikt. Allereerst bevestigde een vergelijking van wildtype, heterozygote en homozygote munc18-1 deficiente muizen de rol van munc18-1 in synaptische secretie. Heterozygote dieren zijn levensvatbaar, bevatten 50% munc18-1 eiwit (vergeleken met wildtype dieren) en hebben synapsen die in staat zijn tot neurotransmitter secretie. Homozygote dieren hebben geen munc18-1 eiwit en zijn niet levensvatbaar, maar ontwikkelen zich wel tot aan de geboorte zonder enige vorm van synaptische activiteit. Heterozygote dieren lieten minder spontane fusie en minder gestimuleerde fusie van neurotransmitter blaasjes zien alsmede een verlaagde respons op hypertone oplossingen en versnelde afzwakking van secretie bij hoogfrequente stimulatie. Uit deze bevindingen is geconcludeerd dat het munc18-1 eiwit nodig is voor secretie daar het synaptische blaasjes toegangkelijk maakt voor fusie (hoofdstuk 2). Homozygote dieren waren verlamd en stierven bij geboorte, vermoedelijk door gebrek aan ademhaling. Analyse van embryonale ontwikkeling door de tijd liet zien dat het mutante centrale zenuwstelsel werd gevormd maar vervolgens weer degenereerde. Neuronale connectiviteit was normaal en synapsen werden gevormd en daarom was het gebrek aan synaptische activiteit niet het gevolg van een gebrek aan neuronal uitgroei of het gebrek aan synapsen. Kennelijk was synaptische activiteit niet zozeer noodzakelijk voor het aanleggen van neuronale contacten in het brein, maar eerder voor het in stand houden hiervan (hoofdstuk 3). Op 16 ontwikkeling dag 16 (E16) gaf analyse van synapsen van de neocortex aan dat wildtype en homozygoot mutante dieren een vergelijkbare synapsmorfologie hadden. Tussen E16 en E18 ontwikkelden wildtype synapsen zich verder terwijl mutante synapsen dat niet deden. Op beide tijdspunten hadden wildtype dieren significant meer synapsen dat mutanten. Mutante dieren hadden daarentegen meer “multivesiculaire structuren” op E18. Dit suggereert dat de mutante synapsen van E16 werden aangepast tot “multivesiculaire structuren” op E18, en dat de synapsen die op E18 gezien werden nieuw waren. Onze resultaten geven ook aan dat een synaps die een paar synaptische blaasjes heeft zich alleen tot volwassenheid kan ontwikkelen wanneer het functioneel is (hoofdstuk 4). Anatomische analyse en gliële kleuring op E18 lieten zien dat neuronen stierven door apoptose voordat ze zich morfologisch konden differentiëren wanneer er geen synaptische activiteit is. Bovendien differentiëren glia zich eerder. TUNEL, macrofaag kleuring en electronen microscopie bevestigden dat cellen stierven door apoptose. Gliogenese vond voortijdig plaats op plekken waar neuronen gedegenereerd waren en met een patroon lijkend op dat in volwassenen. Deze resultaten geven aan dat, in de afwezigheid van fucntionele synapsen, neuronen niet verder differentiëren maar sterven door apoptose (hoofdstuk 5).