Molecular analysis of early specification in the mollusc Patella vulgata

Abstract

Mollusken (o.a. slakken) maken deel uit van de enorm grote groep van invertebraten. De vroege ontwikkeling van de mollusk Patella vulgata is bestudeerd als modelsysteem voor de mollusken. De vroege ontwikkeling van deze zeeslakken kenmerkt zich door enerzijds de manier van klieven, namelijk spiraalklieving, en anderzijds door de vorming van een larvaal stadium, de trochophora larve. De trochophora beweegt zich voort met behulp van een geciliëerde band met cellen, genaamd de prototrooch. De eerste cellen worden al zeer vroeg in de ontwikkeling gevormd tijdens de vierde klieving waardoor een 16-cellig embryo ontstaat. Vier cellen zullen differentiëren (zich ontwikkelen) tot primaire trochoblasten, die nog twee maal delen en daarna ciliën gaan vormen. In dit onderzoek is gekeken naar hoe deze cellen weten dat ze trochoblastcel zijn, met name welke factoren hiervoor bepalend zijn. Al sinds 1900 wordt gedacht dat deze factoren door de moederslak in de eicel worden geplaatst, vandaar de naam maternele factoren, en door de delingen specifiek in de trochoblast cellen terecht komen. Dit proces hebben wij op een moleculair niveau bestudeerd. De trochoblast cellen brengen als enige cellen vanaf het 32-cellig stadium een tubuline gen tot expressie, wat leidt tot de aanmaak van tubuline eiwit dat nodig is voor de ciliën. De regulatie van dit tubuline gen is bestudeerd op het niveau van transcriptie, het overschrijven van het DNA op het chromosoom wat leidt tot de aanmaak van een boodschapper molecuul (mRNA) dat later vertaald wordt in een eiwit. Verschillende factoren zijn noodzakelijk voor deze transcriptionele regulatie, namelijk specifieke stukken in het gen, de ‘cis-acting’ elementen, en ‘trans-acting’ factoren die daar aan kunnen binden, ook transcriptiefactoren genaamd. Voor de regulatie van het tubuline gen zijn twee cis-acting elementen onmisbaar, é é n element waar een remmende factor aan kan binden en é é n element waaraan een activerende factor bindt. In hoofdstuk 3 zijn de resultaten van de zoektocht naar de ‘trans-acting’ factoren die aan deze ‘cis-acting’ elementen binden beschreven. Met een ‘Southwestern assay’, waarin de binding van eiwitten aan stukjes DNA kan worden bestudeerd, is vastgesteld dat de activerende factor waarschijnlijk een klein eiwitje met een molecuulgewicht dat kleiner is dan 20 kDalton. Andere eiwitten die ook aan de belangrijkste ‘cis-acting’ elementen binden met molecuulgewichten van 42 and 55 kDalton werden tevens gevonden. Verder tonen ‘gel shift’ experimenten aan dat er verschillende factoren binden aan de belangrijkste ‘cis-acting’ elementen op verschillende tijdstippen van de ontwikkeling van de larve, wat zou kunnen betekenen dat er verschillende factoren nodig zijn voor het aanschakelen van het tubuline gen tijdens de vroege ontwikkeling en voor het onderhoud van de tubuline expressie later. We hebben geprobeerd om deze factoren met verschillende methoden uit embryos te zuiveren, maar dat is niet gelukt. Met behulp van ‘Cytochalasine B’ experimenten is verder bepaald dat de factoren nodig voor tubuline expressie in de trochoblast cellen al aanwezig zijn in de moedercellen van de trochoblasten op het 8-cellig stadium, de micromeren, en niet in de overige cellen, de macromeren. Tevens is de correcte vorming van de micromeren en de macromeren tijdens de derde klieving, namelijk de vorming van een animale laag (aan de ‘bovenkant’) van vier micromeren bovenop vier macromeren aan de vegetatieve kant (‘onderkant’) van het embryo, noodzakelijk voor correcte tubuline expressie (hoofdstuk 2). Een tweede strategie om de maternele factoren die door de moederslak in het embryo geplaatst worden en die van belang zijn voor het bepalen van de identiteit van een cel, te isoleren was de uitvoering van een ‘differential display’. Er is gekeken naar verschillen in boodschapper moleculen (mRNA’s) tussen de micromeren en macromeren, die coderen voor factoren die de ontwikkeling gaan bepalen. Dit heeft de isolatie van drie interessante eiwitten opgeleverd. Het eerste is glutaredoxin (mi9), een eiwitje dat andere eiwitten kan modificeren door een redox reactie, een chemische reactie door uitwisseling van zuurstof atomen (hoofdstuk 5). Dit eiwitje kan mogelijk transcriptiefactoren die de ontwikkeling van een cel bepalen modificeren en als zodanig de ontwikkeling van bepaalde cellen beïnvloeden. Verder is een transcriptiefactor geïsoleerd, mi10, die de transcriptie van verschillende genen kan reguleren (hoofdstuk 6). Tenslotte Esther32 (E32), een RNA-bindend eiwit, wat de aanmaak van bepaalde eiwitten kan beïnvloeden (hoofdstuk 7). Het mRNA voor dit eiwit komt specifiek in bepaalde cellen voor, die gekenmerkt worden door het feit dat ze nog delen. Niet delende cellen die al gedifferentiëerd zijn, zoals de trochoblasten in de prototrooch hebben E32 mRNA niet. Dit suggereert dat E32 een rol speelt bij het bepalen wanneer een cel stopt met delen en gaat differentiëren. De precieze rol van deze eiwitten tijdens de vroege ontwikkeling van Patella vulgata moet verder onderzocht worden. Verder is er gekeken of het mechanisme dat de trochoblasten in Patella embryos gebruiken voor hun differentiatie ook voor komt bij andere diersoorten die ook een spiraalklieving hebben (hoofdstuk 4). Eerst is gekeken naar andere slakken (van het fylum Mollusca), namelijk de soorten Dentalium en Acantochiton. Deze slakken brengen het tubuline gen van Patella ook specifiek in de trochoblast cellen tot expressie, waaruit kan worden afgeleid dat de factoren nodig voor de expressie van het tubuline gen aanwezig zijn in deze slakken en dat deze slakken waarschijnlijk hetzelfde mechanisme gebruiken voor de expressie van hun eigen tubuline in de trochoblast cellen. Dit zou betekenen dat dit mechanisme voor trochoblast specifieke tubuline expressie evolutionair geconserveerd is in de mollusken en daarom al waarschijnlijk aanwezig was in de voorouder van de slakken. Er is ook gekeken naar andere soorten, namelijk de ‘polychaete’ ringwormen Platynereis, Nereis en Chaetopterus (fylum Annelida), de ‘ribbon’ worm Cerebratulus en de platworm Hoploplana. Van deze wormen brachten é é n embryo van de ringworm Platynereis en meerdere embryos van de ‘ribbon’worm Cerebratulus het Patella tubuline tot expressie. Omdat in de laatste embryos het tubuline gen niet specifiek in de trochoblasten tot expressie werd gebracht, is het nog niet geheel duidelijk of het mechanisme voor trochoblast specifieke tubuline expressie ook buiten het fylum Mollusca geconserveerd is. De experimenten beschreven in dit proefschrift geven aanleiding tot nadenken over de manier waarop cellen tijdens de vroege embryogenese van de mollusc Patella vulgata gespecificeerd worden. Ondanks dat er sterke aanwijzingen zijn dat de trochoblasten gespecificeerd worden door de aanwezigheid van gelocaliseerde maternele factoren, is het niet gelukt om differentiëel gedistribueerde factoren te isoleren. In tegenstelling tot de differentiële distributie van mRNA’s die coderen voor factoren betrokken bij determinatieprocessen in andere soorten zoals de fruitvlieg Drosophila, zijn er in Patella geen differentiëel gedistribueerde mRNA’s gevonden op het 8-cellig stadium. Wel zijn er aanwijzingen gevonden dat door middel van mechanismen op het niveau van de vertalen van mRNA’s (translatie) en eiwitmodificatie (post-translationele modificatie) een differentiële activiteit van determinerende factoren verkregen kan worden. Esther 32 is een RNA-bindend eiwit en zou de translatie van bepaalde voor specificatie belangrijke mRNA’s kunnen beïnvloeden. Glutaredoxin kan eiwitten, waaronder mogelijk transcriptiefactoren, post-translationeel modificeren en de activiteit van mi10, een transcriptiefactor, wordt mogelijk gereguleerd door fosforylatie.